天天快看点丨易基因｜独家分享：高通量测序后的下游实验验证方法——DNA甲基化篇

手机

iphone11大小尺寸是多少？苹果iPhone11和iPhone13的区别是什么？

警方通报辅警执法直播中被撞飞：犯罪嫌疑人已投案

家电

天天快看点丨易基因｜独家分享：高通量测序后的下游实验验证方法——DNA甲基化篇

2023-02-28 11:52:19 来源：博客园

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

此前，我们分享了DNA甲基化研究的测序数据挖掘思路（点击查看详情），进而鉴定出研究的目的基因或目标区域的DNA甲基化。

做完测序后，如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证，则需要进行下游实验设计。DNA甲基化研究的后期验证包括简单验证、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证等。

(资料图)

一、简单验证

目标基因DNA甲基化的验证：Target-BS
检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot

二、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）

DNA甲基化干扰：
DNA甲基化酶的敲降/敲除/过表达
DNA甲基化抑制剂

阿扎胞苷（5-Aza）能够通过与DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共价键抑制其酶活性，使细胞的DNA甲基化水平降低。

检测整体DNA甲基化变化：
5mC甲基化免疫荧光染色（定性）
DNA斑点杂交（定性）
比色法（定量）
质谱法（定量）
检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS
检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot

三、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证

目的基因DNA甲基化的干扰：
荧光素酶活性分析实验（Luciferase activity assay）：使用CpG甲基转移酶在体外将质粒进行甲基化，构建含甲基化/未甲基化启动子的目标基因-荧光素酶表达质粒。
CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化实验：在细胞中人为表达目的基因，或通过CRISPR-Cas9系统靶向编辑DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修饰。
检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS
检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
检测细胞功能受到的影响:
免疫荧光显微观察
功能标志物测定
... ...

CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化技术

目标区域DNA甲基化的验证手段——Target-BS（靶基因重亚硫酸盐测序）

靶向特定区域进行超高深度甲基化测序。
超高深度：可达几百到几千乘。
单个区域长度<300bp
需要设计BS引物，进行预扩增实验。
WGBS vs. TBS相当于RNA-seq vs. RT-qPCR

关于易基因靶基因DNA甲基化测序（Target-BS）

对目标基因/CpG 位点甲基化检测，建立灵活的靶向甲基化测序技术。易基因建立的靶基因甲基化高通量测序（Target Bisulfite sequencing，Target-BS）是针对已有目标基因panel组合，运用易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件，对亚硫酸盐转化后的目标基因多重扩增，建库后进行超高深度（1000X以上）甲基化精准检测。

应用方向：

Target-BS广泛用于已知位点的甲基化Biomarker筛选、验证及临床转化应用

后续目标基因的甲基化验证

技术优势：